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In relazione al grande sviluppo della patologia oncologica e molecolare a cui si è assistito negli ultimi anni, i professionisti e le organizzazioni sanitarie hanno dovuto affrontare tante sfide per cercare di assicurare un’adeguata risposta ai bisogni che si sono venuti a creare.
Lo studio di un elevato numero di geni considerati biomarcatori molecolari di risposta al trattamento è risultato fondamentale al fine di definire una strategia terapeutica quanto più personalizzata possibile per pazienti affetti da specifiche neoplasie solide.
Per permettere la più corretta stratificazione clinica del paziente oncologico, le società internazionali IASCL/AMP/CAP hanno elaborando un pannello di “must test genes” che devono essere testati, ponendo chiarezza a riguardo.
Tra le neoplasie in cui lo studio di biomarcatori predittivi di risposta terapeutica risulta avere un’importanza fondamentale, ritroviamo sicuramente il carcinoma del polmone non a piccole cellule (NSCLC) e il carcinoma sieroso di alto grado dell’ovaio (HGOC).
Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è stato il primo biomarcatore ad essere approvato nella stratificazione del paziente affetto da NSCLC: infatti le mutazioni che ricadono nel dominio tirosino-chinasico di questo recettore permettono ai pazienti di essere trattati con piccole molecole mimetiche dell’ATP. Numerosi studi hanno dimostrato che quest’ultime conferiscono un beneficio clinico in termini di PFS mediana rispetto alla chemioterapia con- venzionale.
L’efficacia e i numerosi vantaggi che la medicina personalizzata comporta al paziente ha por- tato al susseguirsi negli ultimi dieci anni di numerosissimi studi clinici, che hanno consentito l’introduzione di numerosi altri biomarcatori predittivi quali BRAF, se è presente la mutazione puntiforme p.V600E dell’esone 15, le traslocazioni a carico dei geni ALK, ROS1 ed NTRK, target- tabili con farmaci approvati e rimborsati in Italia, le traslocazioni di RET, le mutazioni causative dello skipping dell’esone 14 del gene MET e la mutazione puntiforme p.G12C di KRAS, target- tabili invece con farmaci non approvati in Italia ma disponibili (CNN/EAP), e per ultimo il gene HER2, per le cui mutazioni è stato creato un farmaco al momento disponibile solo nei trail clinici.
Individuare il sottotipo istologico corrispondente al tumore solido in analisi risulta essere fon- damentale al fine di individuare i must genes da analizzare. Il carcinoma del polmone non a piccole cellule è sicuramente l’istotipo polmonare per cui, sia in ambito di ricerca sia in pratica clinica, si indaga il più alto numero di geni. Infatti circa il 40% dei NSCLC non-squamosi ha un target druggable. Tali farmaci target hanno numerosi vantaggi rispetto alle terapie tradizionali: hanno una risposta tumorale maggiore, più rapida, più profonda con durata della risposta e PFS in genere prolungate, inoltre hanno un buon profilo di tollerabilità e possibile impiego anche in pazienti anziani, spesso impossibilitati ad eseguire trattamenti standard.
In casi selezionati, ad esempio in soggetti giovani non fumatori o se i campioni che vengono testati sono piccole biopsie, che potrebbero essere non completamente rappresentative del tumore in analisi, può essere importante testare anche pazienti con NSCLC squamoso, per valutare se è possibile selezionare il paziente ai trattamenti target.
Le alterazioni con chiaro significato patogenetico a carico dei geni BRCA1 e BRCA2 fanno parte del pannello dei must test genes elaborato dalle società scientifiche, nei pazienti affetti da carcinoma sieroso di alto grado dell’ovaio. Le mutazioni definite “patogeniche” nelle proteine BRCA 1 e 2 consentono, in pazienti affetti da OC, il trattamento con inibitori di PARP (PARPi), enzima coinvolto nei meccanismi di riparo del DNA. Tali biomarcatori rappresentano il primo esempio di oncopressore che assume la funzione di selettore positivo ai fini dell’inquadramento clinico del paziente affetto da OC. Nel tumore dell’ovaio avanzato la percentuale delle mutazioni di tipo germinale-somatico, ad oggi detectabili, raggiunge il 50% dei campioni analizzati. Le mutazioni di tali geni possono essere dovute a numerosi fenomeni. Se la mutazione si verifica in seguito ad un deficit di ricombinazione omologa (HRD) si avrà una dis-regolazione nella via delle risorse umane che porta all’instabilità genomica e all’incapacità da parte della cellula di riparare efficacemente il DNA danneggiato. Le cellule HRD positive possono essere più suscettibili agli effetti di agenti dannosi per il DNA come agenti platino o inibitori PARP.
Le mutazione tumorali dei geni oncosoppressori BRCA1 o BRCA2 possono essere sia di tipo germinale (gBRCAmut), che di tipo somatico (sBRCAmut).
Il trattamento con i PARP inibitori in prima linea è considerato al momento il migliore: infatti in pazienti con BRCA mutato è raccomandato il trattamento con Olaparib, in pazienti HRD+ invece la combinazione di due farmaci Olaparib+Bevacizumab sembra essere la più efficace. Questi farmaci, favorendo il riparo del DNA, migliorano la sopravvivenza e aumentano la qualità della vita dei pazienti, inducendo una prognosi statisticamente migliore, soprattutto in presenza di mutazioni di BRCA germinali.

Alla complessità del panorama mutazionale appena descritto si associa la difficoltà tecnico-analitica nell’eseguire il test molecolare: spesso il materiale biologico destinato all’analisi è scarso, in quanto l’esame è richiesto esclusivamente negli stadi IIB-IV di malattia, soprattutto nel NSCLC, o di bassa qualità, a causa di over fissazione dei campioni istologici, come spesso può accadere per l’HGOC. Nel tentativo di superare la problematica dell’esiguità del materiale di ottima qualità a disposizione su cui eseguire i differenti test molecolari, i laboratori di patologia molecolare hanno percepito l’esigenza di trasferire l’attività diagnostica su approcci analitici “multi testing”, come ad esempio il sequenziamento genico di nuova generazione (NGS). L’utilizzo di piattaforme di sequenziamento genico di nuova generazione rappresenta il supporto tecnico più adeguato ai fini della caratterizzazione molecolare sia dei geni BRCA1/2 per l’HGOC, sia dei biomarcatori associati allo NSCLC.
Fino allo scorso anno, per il sequenziamento genico di nuova generazione, nel laboratorio di patologia molecolare predittiva dell’Università degli studi di Napoli Federico II è stato utilizzato un pannello custom, il (SiRe®): questo è in grado di analizzare 568 hotspot mutazionali in sei geni (EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, cKIT e PDGFRa).
Con l’introduzione di nuovi marcatori predittivi terapeutici, tale pannello è risultato essere troppo restrittivo: allo scopo di utilizzare un pannello che ad oggi risultasse quanto più completo possibile è stato selezionato l’Oncomine Precision Assay della Thermofisher .
Per il carcinoma sieroso di alto grado dell’ovaio si è passati, in circa 24 mesi, dalla necessità di caratterizzare un singolo gene per fini terapeutici, all’esigenza di una visualizzazione panoramica molecolare complessissima. Il fatto che nella riparazione del DNA mediante HR vi siano tanti attori è di per sé una complicanza notevole dal punto di vista diagnostico ma, recentemente, è stato dimostrato rappresentare un’importante opportunità dal punto di vista terapeutico. La possibilità di trovare il corretto approccio diagnostico per l’identificazione dello status HRD attraverso differenti metodiche è un tema assai dibattuto dalla comunità scientifica, in particolare da quella interessata al carcinoma ovarico. Lo status del sistema di riparazione del DNA mediante HRR – deficitario o, al contrario, funzionante (deficient o proficient) – ha un riflesso terapeutico, in quanto influisce sulla sensibilità delle cellule tumorali agli inibitori di PARP.
Al fine di ottenere l’analisi dell’HRD, occorre un pannello molto ampio che valuti tutte le mutazioni presenti in un dato campione e, tramite un algoritmo, calcoli uno score.

Esistono numerosi pannelli in grado di analizzare l’HRD di cui sicuramente il Myriad MyChoice CDx è quello più completo e utilizzato.
Nella panoramica dei biomarcatori molecolari sempre più numerosi da ricercare, ha acquisito un valore fondamentale l’utilizzo della biopsia liquida. L’impiego di questo biofluido, soprattutto nell’ambito del NSCLC, risulta avere un’importanza fondamentale, soprattutto nei casi in cui non sia disponibile il materiale cito/istologico del paziente o questo fosse risultato inadeguato all’indagine molecolare. Inoltre la biopsia liquida acquisisce ancora più valore quando utilizzato per la gestione clinica e terapeutica del paziente nel tempo: può infatti essere d’ausilio per andare a tracciare la percentuale di allele mutato associato al tumore e seguire di questo l’andamento nel tempo, senza dover effettuare un nuovo prelievo di tessuto e, talvolta, portando anche un’anticipazione ai risultati delle indagini strumentali.
In ultima analisi, visto l’elevato numero di test molecolari da effettuare, la problematica della scarsa quantità e qualità di materiale, la necessità crescente di individuare biomarcatori in un timing strettissimo e la potenziale utilità della biopsia liquida nella ricerca di biomarcatori, le piattaforme di NGS rappresentano l’approccio più adeguato, non solo in ambito di ricerca ma anche in pratica clinica.